|
|
|
сделать стартовой | добавить в избранное |
 |
|
Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК |
Мыло металлическое "Ликвидатор". 
Коврик для запекания, силиконовый "Пекарь". 
Ночник-проектор "Звездное небо и планеты", фиолетовый. Введение Метод пульс-электрофореза дает возможность разделять ДНК индивидуальных хромосом дрожжей и простейших. Размеры этих молекул варьируют от 0,2 до 10x106 нуклеотидных пар. В настоящее время создана технология выделения и обработки ДНК таких больших размеров как для эукариот, так и для прокариот. Таким образом, теперь существует возможность изучать целые хромосомы, последовательности ДНК которых насчитывают несколько миллионов оснований. Получены физические карты больших районов некоторых хромосом млекопитающих и целой хромосомы Esherichia coli. Цель этой работы – рассказать о биохимических методах, используемых при выделении больших молекул ДНК, и методах ПЭФ, применяемых для их анализа. 1. Приготовление образцов ДНК Препараты ДНК с очень большой молекулярной массой невозможно получить, используя традиционные методы растворения, поскольку такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям. В основе их – огромное осевое отношение молекул ДНК. Например, человеческая хромосома 21-самая маленькая в геноме. Ее ДНК насчитывает 50х10 п. н.и представляет собой единственную молекулу длиной 15 мм. Между тем диаметр этой молекулы всего 20 нм. Таким образом, осевое отношение составляет 10. Для предотвращения разрушительного воздействия сдвиговых сил процедуру экстракции ДНК из клеток проводят в присутствии агарозы. Этот прием достаточно прост, и получаемые таким способом образцы можно затем использовать в традиционных электрофоретических опытах и экспериментах по клонированию. Живые клетки суспендируют в расплавленной низкоплавкой агарозе. Затем агарозе дают застыть в формочках объемом 100 мкл для формирования блоков, называемых вставками. Формочки можно приобрести у фирмы Pharma-cia-LKB или сделать самим, соединив вместе «хвост к голове» обычные гребенки для электрофореза нужных размеров. Все манипуляции с формочками следует проводить так, чтобы предотвратить их загрязнение нуклеазами. Перед употреблением формочки необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и вытереть, одев перчатки. Затем одна сторона формочки заклеивается лентой, используемой в качестве донышка.В качестве альтернативы агарозным блоквставкам могут выступить агарозные гранулы. Для их получения клеточную суспензию в агарозе по каплям добавляют в масло с одновременным перемешиванием. Размеры гранул контролируются скоростью перемешивания. С образцами ДНК в гранулах можно обращаться так же, как с растворенными. Однако мы предпочитаем использовать агарозные вставки, так как с ними проще работать. Для выделения ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки, поместите заполимеризовавшиеся агарозные вставки в раствор ESP и инкубируйте 2 дня при 50°С. В этом растворе происходит лизис клеток и отделение белков и других молекул от ДНК. Интактную хромосомную ДНК можно анализировать с помощью ПЭФ непосредственно из раствора ESP. Образцы ДНК в растворе ESP хранятся неопределенно долго при 4°С или даже при комнатной температуре прямо в пробирках Эппендорф. При наличии клеточной стенки ее необходимо удалить перед экстракцией ДНК, поместив клетки в раствор ESP. Методики выделения ДНК из клеток с интактной стенкой представлены в табл.
4–6. Состав клеточной стенки значительно варьирует для различных организмов. В некоторых случаях может оказаться необходимым подбор различных ферментов, расщепляющих полисахариды клеточной стенки. Многие из этих ферментов не требуют для своей работы присутствия двухвалентных катионов. Таким образом, обработка этими ферментами может проводиться в присутствии большого количества ЭДТА для предотвращения деградации хромосомной ДНК- Все образцы должны быть обязательно проинкубированы в растворе ESP в течение 2 дней при 50°С. Вставки станут прозрачными гораздо раньше окончания инкубации. Однако инкубацию следует продолжить, чтобы добиться полного отделения от ДНК связанных с ней различных молекул. Белки, связанные с ДНК, могут изменять ее электрофоретическую подвижность. Кроме того, образцы, проинкубированные более короткое время, оказываются устойчивыми к воздействию некоторых рестриктаз. Наиболее общая проблема, возникающая при использовании описанной ниже техники получения ДНК из новых организмов, – это измерение конечной концентрации ДНК. Надо стремиться к тому, чтобы концентрация ДНК в агарозной блоквставке была «удобна» для нанесения на форезный гель. Такая концентрация должна быть определена эмпирически. Возможное число клеток и количество ДНК предложены в прилагаемых протоколах опытов. Эти цифры можно использовать как предварительные и менять в зависимости от условий куль- 1. 50 хисходный раствор Денхардта Этот раствор – одни из компонентов смеси для прегибрндизации и гибридизации На 500 мл раствора: поливинилпирролидои 5 г, фиколл 5 г, БСА, фракция V 5 г. Простерилизуйте фильтрацией через одноразовый фильтр и храните в аликвотах по 30 мл при – 20°С. 2. Раствор для лизиса клеток Е. coli Раствор можно использовать для приготовления сферопластов из различных бактерий Конечные концентрации На 1 л 6 мМ трис-HCl 6 мл 1 М раствора 1 М aCl 58,4 г 100 мМ ЭДТА 100 мл 0,5 М раствора 0,5% бридж-58 60 мл 10%-ного раствора 0,2% дезоксихолата 50 мл 4%-ного раствора 0,5% са ркозила 5 мл 100%-ного раствора Проавтоклавируйте Добавьте свежими: 1 мг/мл лизоцима яичного белка 20 мкл/мл бычьей панкреатической РНКазы 3. ESP Этот раствор используется для выделения любых больших молекул ДНК. Он имеет еще одно название – DS. Конечные концентрации 0,5 М ЭДТА Автоклавируйте 1% лаурилсаркозин Тщательно перемешайте до полного растворения 1 мг/мл протеиназы К Инкубируйте 2 ч при 37°С Храните в аликвотах замороженным Для работы: смешайте с равным объемом образца и инкубируйте 1–2 дня при 50°С. 4. Смесь для прегибрндизации и гибридизации Конечные концентрации На 1 л 3хSSC 100 мл 30 X раствора 0,1% SDS 5 мл 20%-иого раствора 10Х раствор Денхардта 200 мл 50х раствора 10% декстрансульфат&g ; 200 мл 50%-го раствора ДНК спермы лосося 5 мг/мл Смесь храните замороженной в аликвотах по 30 мл для прегибридизационного раствора и в аликвотах по 20 мл для гибридизационного раствора. 5. 1ХМ9 На 1 л: 50 г. a2HPO « 30 г. КН2Р04 5 г aCl 10 г. H4C1 Разведите до однократной концентрации и проавтоклавируйте. После автоклавирования добавьте Конечные концентрации На 1 л 1 мМ MgS04 1 мл 1 М раствора 0,1 М СаС12 0,2 мл 0,5 М раствора 0,4% глюкоза 10 мл 40%-ного раствора 0,5% казаминокислот 25 мл 20%-ного раствора Необязательные добавки 50 мкл/мл аминокислот 10 мл раствора 5 мг/мл 10 мкг/мл витаминов 10 мл раствора 1 мг/мл 50 мкг/мл оснований 25 мл раствора 2 мг/мл 6.
Pe IV Этот раствор предназначен для отмывки бактериальных клеток перед выделением сферопластов Конечные концентрации На 1 л 10 мМ трис-HCl 10 мл 1 М раствора 1 М aCI 58,44 г. Проавтоклавируйте. 7. 0,1 М ФМСФ Раствор используется для инактивации протеиназы К. Ресуспендируйте 17,5 мг ФМСФ в 1 мл изопропанола. Помните, что раствор нестабилен, поэтому его надо использовать свежим и готовить перед употреблением. ФМСФ очень токсичен. 8. PSG Этот раствор используется для отмывки простейших перед лизисом. Конечные концентрации На 1 л 75 мМ a-фосфатный буфер 75 мл 1 М раствора 65 мМ aCI 13 мл 3 М раствора 10% глюкоза 100 г. Проавтоклавируйте. Организм Концентрация клеток в 100 мкл блок-вставки Нагрузка на дорожку при форезе rypa osoma brucei Plasmodium falciparum Giardia lambia Leishma ia 2х10х10 1Х10 2х10 1/16 1/8 1/10 1/16 Известно, что хромосомная ДНК из-за больших размеров молекулы чрезвычайно чувствительна к воздействию нуклеаз. В связи с этим необходимо принять за правило предварительно обрабатывать все растворы, контактирующие с ДНК. Растворы следует разлить на небольшие порции и простерилизовать. Стерильными должны быть и посуда, и оборудование. Для переноса образцов из вставок или из трубочек можно использовать изогнутую стеклянную палочку, простерилизованную в спирте и в пламени горелки. При работе с образцами ДНК нельзя пользоваться никакими приспособлениями, содержащими металлические детали, в частности из нержавеющей стали, а также шпателями и бритвенными лезвиями. ДНК прочно связывается со многими бивалентными металлами и контакт с ними обычно приводит к появлению разрывов в молекуле ДНК. 2. Приготовление вставок с образцами ДНК простейших Свободно живущие простейшие могут быть прямо использованы для приготовления вставок с препаратами ДНК. Их можно отделить от культуральной среды центрифугированием. Перед приготовлением вставок внутриклеточных паразитов выделяют из клеток крови или других хозяйских клеток. Эритроциты можно лизировать, как указано в табл. 3. В некоторых случаях трипаносом выделяли из различных клеточных элементов с помощью ионно-обменной хроматографии на ДЕАЕ-носителе. 2.1 Выделение ДНК из культивируемых клеток и лимфоцитов Процедуры получения ДНК из культивируемых клеток и из простейших имеют много общего. Для рестрикционного картирования необходимо использовать клеточные линии только с нормальным стабильным геномом. Например, клетки HeLa очень удобны для культивирования, но содержат большое количество хромосомных перестроек и имеют разную плоидность. Один миллион диплоидных клеток должен содержать примерно 6,6 мкг ДНК, что соответствует размерам генома 6х10 нуклеотидных пар. Поскольку несинхронизированные клеточные культуры обычно представляют собой смесь диплоидных, тетраплоидных и промежуточных состояний, мы используем для работы 1х10 клеток, считая, что они содержат примерно 10 мкг ДНК. Процедуру, описанную в табл. 3, использовали также для получения интактных хромосом из различных клеточных линий насекомых. При этом концентрация клеток должна быть пересчитана в соответствии с меньшими размерами генома.
Были даже найдены окаменевшие яйца пресмыкающихся, отложенные на суше целыми гнездами. Эти гнезда были занесены песком во время какого-нибудь урагана и потому сохранились в целости до нашего времени. Зюсс был глубоким мыслителем. Мир представлялся ему в виде бесконечного комплекса тесно связанных друг с другом вопросов, участвовать в разрешении которых было задачей его жизни, и это воодушевляло его. Когда его занимала какая-либо проблема, он посвящал ее изучению всю свою энергию, все свое внимание, отстраняя на это время все другие научные вопросы. Добившись разрешения поставленной проблемы, он старался изложить результаты исследования в наиболее ясном и сжатом виде, ограничиваясь самой сущностью, отбрасывая все мелочи, не вдаваясь в полемику. Споры о приоритете были для него невыносимы, и он никогда ими не занимался. Благодаря такому методу работы большая часть печатных трудов Зюсса отличается небольшим об'емом и не дает представления о том количестве времени и труда, которое было на них затрачено. Это касается главным образом его стратиграфических исследований
1. Современные методы работы с поставщиками в газовой отрасли
2. Методы работы с материалами прессы на уроке французского языка
3. Свойства артериального пульса и методы исследования артериального давления
4. Методы работы с потребителем туристских услуг
5. How "DNA" testing works Анализ "ДНК" как проверяющие работы)
9. Основные методы и содержание профориентационной работы
10. “Идеальные типы” как метод исследования культуры по работам М. Вебера в его избранных произведениях
11. Методы диагностики потенциальных факторов риска (рискогенных сотрудников) в работе с персоналом
12. Применение метода электрофореза при контроле состава питьевых, природных и сточных вод
13. Элементы метода капиллярного электрофореза
14. Методы психоаналитической психодиагностики в психокоррекционной работе
15. Использование PR-методов в работе субъектов современного рыночного пространства с телевизионными СМИ
16. Финансовые методы повышения эффективности работы предприятий, организаций
Каталка-мотоцикл "МХ". 
Крем для младенцев "Weleda" для защиты кожи в области пеленания (с календулой), 75 мл. 
Набор текстовыделителей "Frixion Light", 3 цвета, 1-3 мм. 17. Этика социальной работы (методичка)
18. Методы воздействия в информационно-воспитательной работе
19. Методы психоаналитической психодиагностики в психокоррекционной работе
21. Формы и методы племенной работы в племзаводе, племрепродукторе, фермерском хозяйстве
25. Мастерство классного руководителя: сущность и методы его работы
26. Методы и приемы словарной работы на уроках русского языка в начальной школе.
27. Методы и формы работы социального педагога с неполной семьёй
28. Современные формы и методы воспитательной работы
29. Методы и особенности работы практического психолога в области помощи ребенку с аутизмом
30. Метод отдельного случая (кейс-стади) и его использование в практике социальной работы
31. Методы групповой креактивной работы
32. Методы теории социальной работы
Набор цветных карандашей Trio, 12 цветов. 
Домик игровой с забором. 
Стиральный порошок с ферментами "Top Home", 900 г. 33. Методы организации дорожно-строительных работ
35. Производство отделочных работ
36. Разработка основных разделов проекта производства работ
41. Создание Вселенной или большой взрыв
42. Исследование природных ресурсов планеты с помощью космических методов
43. Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии
45. Регистрация сигнальных молекул
46. Методологическое значение сравнительного метода в зоологических исследованиях
48. Контрольная работа по физиологии
Микрофон "Новогодние песенки". 
Подставка для ножей, 11x22 см, синий. 
Настольная семейная игра "Ловушка для пингвина". 49. Новейшие методы селекции: клеточная инженерия, генная инженерия, хромосомная инженерия
50. Воспитательная работа в вооруженных силах и ее влияние на психику воина в боевой деятельности
51. Спасательные и неотложные аварийно-восстановительные работы
52. Организация и проведение спасательных работ в чрезвычайных ситуациях
58. Гидрохимический, атмохический и биогеохимический методы поисков
59. Буровые работы
60. Геологическая история развития Австралии. Большой Водораздельный хребет
61. Государственное регулирование экономики: формы и методы
63. Предмет, метод, источники Административного права
64. Нелегальная миграция в России и методы борьбы с ней
Лестница-стремянка, 2 ступени, стальная. 
Дневник школьный "Герб". 
Велосипед трехколесный Moby Kids "Comfort. EVA", цвет: синий. 65. Предмет и метод гражданского права
66. Исключительные права на средства индивидуализации товаров, работ, услуг и их производителей
67. Контрольная работа по всеобщей истории государства и права
68. Формы и методы государственного регулирования экономики в Казахстане
69. Математические методы и модели в конституционно-правовом исследовании
73. Прием на постоянное место работы
74. Лабораторные работы по охране труда в Угольной промышленности
75. Методы комплексной оценки хозяйственно-финансовой деятельности
76. Контрольная работа по курсу экологического права
77. Контрольная работа по Английскому языку
78. Цикл-метод обучения. (Методика преподавания эстонского языка)
79. Эффективные методы изучения иностранных языков
80. Диапазон голоса и работа над ним
Глобус Земли, физико-политический, рельефный с подсветкой, 250 мм. 
Средство для умягчения воды Calgon "2 в 1" (1,6 кг). 
Пакет полиэтиленовый с вырубной ручкой "Золотая полоса", ПВД, 40х47 см, 55 мкм, 50 штук. 81. Теория книговедения в работах М.Щелкунова
82. Метод действенного анализа в режиссуре театра, кино и телевидения
83. Естественная и гуманитарная культуры. Научный метод
84. Соцреализм как метод искусства
85. Дидактические возможности отдельных методов обучения на уроках литературы в старших классах
89. Работа Н.А. Бердяева "Смысл истории"
90. Цивилизационные методы в изучении истории
92. Методы компьютерной обработки статистических данных. Проверка однородности двух выборок
93. Решение транспортной задачи методом потенциалов
94. Решение дифференциальных уравнений 1 порядка методом Эйлера
95. Программные средства и приёмы работы на компьютере
96. Электронная почта и факсимильная связь. Структура и прицип работы
Ручка перьевая "Velvet Prestige", синяя, 0,8 мм, корпус черный/золото. 
Сушилка для белья "Ника" напольная складная, 20 метров. 
Карандаши художественные "Polycolor", 36 цветов, 36 штук, деревянная коробка. 97. Разработка методов определения эффективности торговых интернет систем
98. Диагностика и устранение неисправностей при работе в локальной сети
99. Информационные потоки в ЭВМ. Алгоритм работы процессора
