|
|
|
сделать стартовой | добавить в избранное |
 |
|
Генная инженерия |
Фонарь садовый «Тюльпан». 
Забавная пачка денег "100 долларов". Введение Генную инженерию составляет совокупность различных экспериментальных приемов (методик), обеспечивающих конструкцию (реконструкцию) и клонирование молекул ДНК (генов) с заданными целями. Методы генной инженерии используют в определенной последовательности, причем различают несколько стадий в выполнении типичного генно-инженерного эксперимента, направленного на клонирование какого-либо гена, а именно: 1. Выделение ДНК из клеток интересующего организма (исходного) и выделение ДНК-вектора. 2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного организма на фрагменты, содержащие интересующие гены, с помощью одного из ферментов-рестриктаз и выделение этих генов из образованной рестрикционной смеси. Одновременно разрезают (рестрикциируют) векторную ДНК, превращая ее из кольцевой структуры в линейную. 3. Смыкание интересующего сегмента ДНК (гена) с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК. 4. Введение гибридных молекул ДНК путем трансформации в какой-либо другой организм, например, в Е. coli или в соматические клетки. 5. Высев бактерий, в которые вводили гибридные молекулы ДНК, на питательные среды, позволяющие рост только клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК. 6. Идентификация колоний, состоящих из бактерий, содержащих гибридные молекулы ДНК. 7. Выделение клонированной ДНК (клонированных генов) и ее характеристика, включая секвенирование азотистых оснований в клонированном фрагменте ДНК. ДНК (исходная и векторная), ферменты, клетки, в которых клонируют ДНК — все это называют «инструментами» генной инженерии. Выделение ДНК Рассмотрим методику выделения ДНК на примере ДНК плазмид. ДНК из плазмидосодержащих бактериальных клеток выделяют с помощью традиционной техники, заключающейся в получении клеточных экстрактов в присутствии детергентов и последующем удалении из экстрактов белков фенольной экстракцией Полная очистка плазмидной ДНК от белков, РНК и других соединений проводится в несколько стадий. После того как клетки разрушены, например, с помощью лизоцима (растворены их стенки), к экстракту добавляют детергент, чтобы растворить мембраны и инактивировать некоторые белки. Большинство хромосомной ДНК удаляют из получаемых препаратов обычным центрифугированием. Часто для полной очистки используют хроматографию. Если требуется очень тщательная очистка, используют высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотности CsCI с использованием этидия бромида. Оставшаяся хромосомная ДНК будет фрагментирована в линейную, тогда как плазмидная ДНК останется ковалентно закрытой. Поскольку этидий бромид менее плотен, чем ДНК, то при ультрацентрифугировании в центрифужной пробирке будет «выкручиваться» два кольца — плазмидная ДНК и хромосомная ДНК Плазмидную ДНК отбирают для дальнейшей работы, хромосомную ДНК выбрасывают. Ферменты-рестриктазы и рестрикция ДНК В ходе эволюции бактерии развили способность синтезировать так называемые рестрицирующие ферменты (эндонуклеазы), которые стали частью клеточной (бактериальной) системы рестрикции-модификации. У бактерий системы рестрикции-модификации являются внутриклеточной иммунной системой защиты от чужеродной ДНК.
В отличие от высших организмов, у которых распознание и разрушение вирусов, бактерий и других патогенов происходит внеклеточно, у бактерий защита от чужеродной ДНК (ДНК растений и животных, в организме которых они обитают) происходит внутриклеточно, т. е. тогда, когда чужеродная ДНК проникает в цитоплазму бактерий. С целью защиты бактерии в ходе эволюции развили также способность «метить» собственную ДНК метилирующими основаниями на определенных последовательностях. По этой причине чужеродная ДНК из-за отсутствия в ней метальных групп на тех же последовательностях плавится (разрезается) на фрагменты разными бактериальными рестриктазами, а затем деградируется бактериальными экзонуклеазами до нуклео-тидов. Можно сказать, что таким образом бактерии защищают себя от ДНК растений и животных, в организме которых они обитают временно (как патогены) или постоянно (как сапрофиты). Рестриктазы впервые были выделены из Е. coli в 1968 г- Оказалось, что они способны разрезать (плавить) молекулы ДНК на разных сайтах (местах) рестрикции. Эти ферменты получили название эндонуклеаз класса I. Затем у бактерий были обнаружены эндонуклеазы класса II, которые распознают в чужеродной ДНК сайты рестрикции специфически и на этих сайтах тоже осуществляют рестрикцию. Именно ферменты этого класса стали использовать в генной инженерии. Тогда же были открыты ферменты класса III, которые плавят ДНК рядом с сайтами распознания, но эти ферменты не имеют значения в генной инженерии. Действие системы рестрикции-модификации «рационализуется» так называемыми палиндромными (распознающими последовательностями) азотистых оснований, которые являются сайтами рестрикции ДНК. Палиндромные последовательности — это последовательности оснований, которые одинаково читаются вперед и назад, как, например, последовательность букв радар. Поскольку цепи ДНК обладают антипараллельным направлением, то считают, что последовательность является палиндромной, если она идентична, когда читается в направлении от 5'- к 3'-концу на верхней и 3'- к о'-концу на нижней цепи, а именно: Палиндромы могут быть любых размеров, но большинство тех палиндромов, которые используют в качестве сайтов узнавания рестриктазами, состоят из 4, 5, 6 и реже 8 оснований. Рестриктазы — это абсолютно необходимый инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктаз и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК. Замечательной особенностью рестриктаа является то, что они продуцируют разрезы молекул на несколько фрагментов (рестрик-тов) ДНК уступами, в результате чего в образующихся концах одна цепь длиннее другой, образуя своеобразный хвост. Такие концы (хвосты) получили название «липких» концов т. к. они способны к самокомплементарности. Рассмотрим результаты рестрикции на примере одной из наиболее известных рестриктаз Eco RI из системы рестрикция—модификация Е. coli. Вместо того, чтобы плавить ДНК в центре па-линдромной последовательности узнавания, этот фермент плавит ДНК за пределами центра и продуцирует 4 самокомплементарных («липких») конца, состоящих из разного количества нуклео-тидов, а именно: Эти «липкие» концы в генно-инженерных опытах полезны по той причине, что они могут быть воссоединены комплементарно при низких температурах, что позволяет эффективное смыкание ДНК-фрагментов.
Сайты распознания и сайты плавления в случае других рестриктаз имеют другое содержание, а именно: Вслед за рестрикцией ДНК из рестрикционной смеси выделяют рестрикционные ДНК-фрагменты (ДНК-рестрикты), которые необходимы затем для объединения с вектором. Для выделения ДНК-рестриктов прибегают к электрофорезу, поскольку с помощью этого метода рестрикцированную ДНК очень легко фракционировать благодаря размерам фрагментов-рестриктов и благодаря константным отношениям электрический заряд-масса. Фрагменты в электрическом поле мигрируют в ходе электрофореза при частоте, зависимой от их размеров (массы). Чем больше (длиннее) фрагмент, тем медленнее он мигрирует в электрическом поле. Материалом, в котором проводят электрофорез, являются незаряжающиеся агаро-за и полиакриламид. Для опознания фрагментов используют эти-дий бромид, который красит фрагменты, что ведет к их более легкому обнаружению Результативность электрофореза очень высока, поскольку с его помощью могут быть разделены фрагменты, размеры которых составляют от 2 до 50 000 оснований. После электрофореза фрагменты из агарозы выделяют с помощью разных методов. На основании результатов сравнения размеров рестриктов одной и той же ДНК, полученных с помощью разных рестриктаз, строят рестрикционные карты, на которых показывают сайты рестрикции каждой из использованных рестриктаз В практическом плане рестрикционные карты позволяют определять не только размеры рестриктов, но и выяснять расположение в молекулах ДНК локусов тех или иных генов. Поскольку у высших организмов в ходе транскрипции синтезируется гетерогенная ДНК, корректируемая процессингом, то в генной инженерии обычно используют комплементарную ДНК (кДНК), которую получают при использовании в качестве матрицы мРНК, на которой обратная транскриптаза синтезирует одноцепочечную ДНК (кДНК), являющуюся копией мРНК. В последующем эти одноцепочечные ДНК превращают в двухцепочечные ДНК. Считают, что кДНК содержит непрерывные нуклеотидные последовательности (транскрибируемые и транслируемые). Именно кДНК используют для рестрикции. Выделенные после электрофореза из агарозных гелей фрагменты ДНК (рестрикты) можно предварительно подвергнуть секвени-рованию, т. е. определить в них нуклеотидную последовательность. Для этого используют химический и ферментативный методы сек-венирования. Химический метод основан на получении меченных радиоактивным фосфором (32р) фрагментов и удалении из этих фрагментов одного из оснований с последующим учетом результатов радиоавтографии гелей, содержащих эти фрагменты. Ферментативный метод основан на том, что в конец анализируемого фрагмента вводят нуклеотид, используемый затем в синтезе разных фрагментов i vi ro, анализируемых на нуклеотидную последовательность электрофоретически. Для изучения специфических последовательностей нуклеотидов в молекуле ДНК используют также гибридизацию ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК, Нозерн- и Саузерн-блоттинги. Генетические векторы Сегмент ДНК (ген), который предназначен для молекулярного клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его в бактериальную клетку, т.
Наиболее реалистичным выглядело нахождене способа "перекрыть" места соединения вируса с белком на поверхности клеток. Если, например, "заткнуть" эти места другими молекулами, возможность прикрепления первого ко второму будет исключена. Перс-пективным также выглядит вакцинация людей фрагментами белка CCR-5, которые могут вызвать образование иммунной системой организма собственных антител, связывающих этот белок. Возможным представляется также использование генной инженерии, чтобы снабдить макрофаги новыми генами, чьи производные блокировали бы производство CCR-5. Изучаются и другие возможности - не только предупреждения, но и лечения да-леко зашедших заболеваний. Установлено также, что отдельные индивидуумы, гомози-готные по мутантному гену, были, тем не менее, инфицированы HIV. Это вынуждает считаться с возможностью существования особо вырулентной линии этого возбудителя. Что-ж, ничего необычного в этом нет, то же наблюдается и у возбудителей других забо-леваний. Как и во многих других случаях, по мере решения одной проблемы в медицине, возникают другие
1. Генно-инженерные методы как новый биотехнологический подход в аграрном секторе США
2. Этические проблемы генных технологий
3. Клонирование и этическая проблема
4. Рекомбинантные вакцины (Генная инженерия)
5. Новейшие методы селекции: клеточная инженерия, генная инженерия, хромосомная инженерия
10. Достижения генной инженерии и биотехнологии
11. Отрасли применения генной инженерии
12. Генная инженерия
14. Инженерный труд России. Повышение квалификации инженера
15. Политический гений Екатерины 2
16. Гений и злодейство - две вещи несовместные
Смываемые фломастеры "Супер чисто", 12 штук. 
Кукла Нэни, в вязаном жакете. 
Стираемая карта "Моя Россия". 17. Гены
18. Геном человека
19. Факторы, вызывающие мутации на генном уровне
20. Генная терапия – новая эра новой эры
21. Биотехнология и «горизонтальный» перенос генов
25. Загадка гения: Пушкин и литературный язык
26. Беспокойный гений Эрнста Хладни
27. Мутации и новые гены. Можно ли утверждать, что они служат материалом макроэволюции?
28. Тепловой шок развивающегося мозга и гены, детерминирующие эпилепсию
29. Гены и судьба (генетико-философские аспекты)
30. Дрейф генов
Тележка на стол, красная. 
Комплект "Mobile" Раптор, прибор на батарейках и сменный картридж, 240 часов. 
Доска магнитно-маркерная "ECO", деревянная рамка, 40х60 см. 33. Гены управляют поведением, а поведение — генами
35. Гены-маркеры предрасположенности к скоростно-силовым видам спорта
36. Новейшие генные структуры и их анализ
37. Основные типы взаимодействий генов
41. Взаимодействие генов, генетика человека, селекция растений и животных
43. Геном человека
44. Действие генов
45. Феномен "злого гения" в деструктивных сектах
46. Визуализация генов: методы и проблемы
47. Никола Тесла (Nikola Tesla). Гений-одиночка или безумец опередивший своё время?
48. Теоретичні основи генно-модифікованих продуктів
Трикотажная пеленка кокон "Bambola" (цвет: бежевый). 
Сейф-книга "Alparaisa СС0023/1" (карта первооткрывателей). 
Набор столовый детский "Юниор" (2 предмета). 51. Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири
53. Как стать гением переговоров?
57. О роли эксперимента в разработке научных гипотез происхождения жизни
58. О вопросе клонирования в современном естествознании
60. Оценка инженерной, пожарной и химической обстановок на ОНХ "Маш завод"
62. Траншейные коробки и участок строительства (ответственность инженеров и строителей)
63. Процесс законотворчества и его стадии в России
Папка для чертежей "Городская площадь", А3. 
Планшетик "Всё обо всём". 
Дополнительный набор "Магнитные истории. Времена года". 65. Инженерия знаний. Создание системы "Посредник", заключающей договоры на поставку стройматериалов
66. Обработка результатов эксперимента
67. Полинаркомания (опийная, кокаиновая), II стадия, с психотическими эпизодами, суицидальное поведение
68. Эффективность влияния озона на течение перитонита и процесс спайкообразования в эксперименте
69. Стадии совершения умышленного преступления
74. Характеристика метода эксперимента
75. Расчет подземных инженерных сетей
77. Психология труда и инженерная психология
79. Эксперимент как средство оценки качества теоретического знания
Таз со стиральной доской. 
Пистолет для подкачки шин, пневматический. 
Подставка для колец "Единорог", арт. 62243. 81. Клонирование "За" и "Против"
82. О вопросе клонирования в современном естествознании
85. Концепция "социальной инженерии" А.К.Гастева
89. Инженерия знаний
90. О трояком аспекте языковых явлений и об эксперименте в языкознании
91. Поэтические игры с пустотой московского концептуализма (эксперименты Д.А. Пригова)
93. Дикой и Кабаниха (исключение в русском купечестве или они типичны?)
94. Вычислительный эксперимент
95. Оценочный и сравнительный эксперимент
96. Случайный эксперимент, элементарные исходы, события
Датчик протечки воды "Сирена AL-150", напольный 90 дБ, батарейка в комплекте. 
Игра с прищепками "Зайка". 97. Типичные пневмонии у детей
98. Стадии и формы опьянения и алкоголизма
99. Методы анализа наиболее типичных проблем управления проектом
100. Жизненные стадии и циклы организации
Совок большой. 
Тележка для маркета.