|
|
|
сделать стартовой | добавить в избранное |
 |
|
Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии |
Браслет светоотражающий, самофиксирующийся, желтый. 
Чашка "Неваляшка". 
Ночник-проектор "Звездное небо и планеты", фиолетовый. БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТБиологический факультет кафедра генетики и биотехнологии ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ Курсовая работа студентки 3 курса ШУТ М.В. Научный руководитель: канд. биол. наук, доцент ГЛУШЕН С. В. Минск 2001г. ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 4 1.Общие принципы проточной цитометрии .4 2. Анализ ДНК-гистограмм .5 3. Анализ параметров клеточного цикла .9 4.Наиболее употребительные методики, используемые в цитометрии клеточного цикла .14 5.Применение цитометрии в молекулярной клинической диагностике .17 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .22 ЛИТЕРАТУРА .23 ВВЕДЕНИЕ Возможности применения методов количественной цитометрии в биологических и медицинских исследованиях очень широки. Они включают множество задач, начиная от поиска наиболее информативных морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением гетерогенных популяций исследуемых объектов. Хотя эти задачи могут решаться на различных экспериментальных моделях или клиническом материале, общие принципы остаются одинаковыми как для тех, так и других объектов. В настоящее время цитометрию принято подразделять на проточную и статическую. Первый вариант цитометрии осуществляется с помощью специальных приборов – проточных цитометров и сортеров. Для статической цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах. Существует много методик, которые с одинаковым успехом можно воспроизводить как с помощью проточной, так и статической цитометрии. Более того, статическая цитометрия в некоторых случаях позволяет получить более обширную информацию о клетках, причем ее производительность не намного меньше проточной. Настоящий обзор литературы посвящен применению цитометрии для оценки параметров клеточного цикла на экспериментальном и клиническом материале. Хотя в обзоре в основном приводятся сведения, касающиеся проточной цитометрии, с учетом изложенного выше они в значительной степени распространяются также и на статическую цитометрию. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.Общие принципы проточной цитометрии Метод проточной цитометрии сформировался за последние 30 лет на основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их размеров. В 1965 г. появилось первое сообщение о клеточном сортере, а в 70-х годах стали выпускать приборы, способные измерять интенсивность флуоресценции при двух и более длинах волн и определять сразу несколько клеточных параметров. В настоящее время выпускают два основных типа приборов для проточной цитометрии: 1) простые в использовании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10є (малоугловое прямое рассеяние) и 90є; 2) большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с заданным набором этих параметров. Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный.
Свет определенной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации. Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных реакций (M.G.Ormerod, 1990). В продаже имеются разные проточные цитометры, и изложить общие принципы их работы сложно. Можно отметить лишь несколько моментов, общих для всех приборов: для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток; клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве; для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток, необходимо использовать всю доступную информацию, например данные по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его ширине. 2. Анализ ДНК-гистограмм Измерение содержания ДНК – одно из самых простых и распространенных применений проточной цитометрии. Первые ДНК-гистограммы, полученные в 1969 г.(M.A.Va Dilla, . . rujillo, P.F.Mulla ey, J.R.Coul er, 1969), позволили четко различить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/М-фазах клеточного цикла. С тех пор появилось множество работ по измерению содержания ДНК в клиническом материале, полученном в основном от больных раком. Из ДНК-гистограмм можно получить два рода данных. Во-первых, идентифицировать клетки с аномальным содержанием ДНК (рис.1, Б), так называемые анеуплоидные клетки. Во-вторых, определить долю клеток, находящихся в S-фазе (SPF), и оценить степень пролиферации. Как правило, в клеточной популяции с высокой пролиферативной активностью число клеток в S-фазе больше, чем обычно. Международный комитет по аналитической цитометрии (W.Hoddema , J.Schuma , M.A dreeff, B.Barlogie, C.J.Herma , R.C.Lief e .al, 1984) попытался стандартизировать множество способов анализа ДНК-гистограмм, и тем не менее для анализа продолжают использовать различные подходы, часто с привлечением компьютерных прграмм. Далее будут рассмотрены некоторые из этих подходов : Вычисление коэффициента вариации (CV) Самый простой способ оценки качества результатов основан на вычислении CV для G1-пика ДНК диплоидных клеток. Эта величина определяется из приведенного ниже соотношения в предположении, что G1-пик следует нормальному распределению: CV = W / (M · 2,35), Где W – ширина пика на уровне полувысоты, М – номер канала для максимума G1- пика. Чем меньше CV и чем лучше G1-пик отвечает нормальному распределению, тем качественнее результаты. В действительности качество ДНК-гистограмм, как правило, не очень высоко, и чтобы судить о достоверности результатов, полученных при клинических исследованиях, приходится оценивать средний CV и диапазон его значений.
Вычисление индекса ДНК Индекс ДНК для «анеуплоидного» пика (пиков) на гистограммах с двумя или более G1-пиками (рис.1, Б) вычисляют, ориентируясь на «диплоидный» G1-пик. Так, на рис. 1, Б G1-пику для опухолевых клеток соответствует вдвое большее количество ДНК, чем G1-пику диплоидных клеток, поэтому индекс ДНК для него равен 2,0. Для анеуплоидных клеток, содержащих на 50% больше ДНК, чем нормальные, индекс равен 1,5. Анеуплоидию можно выявить только в тех случаях, когда на гистограммах имеется не менее двух G1-пиков. Чтобы установить, какой из близко расположенных друг к другу G1-пиков соответствует диплоидным клеткам из свежих образцов ткани, можно использовать внешний ДНК-стандарт. Если присутствуют только диплоидные клетки, то ИД считают равным 1,0. Основная проблема при определении плоидности связана с трудностью выявления малого числа анеуплоидных стволовых клеток. Еще труднее идентифицировать малочисленные тетраплоидные стволовые клетки, поскольку такие клетки в G1-фазе по содержанию ДНК равноценны диплоидным клеткам в фазе G2. Так, в отличие от рис 1, Б, на котором четко виден высокий «тетраплоидный» пик, на рис.1, А обнаруживается лишь слабый пик, соответствующий четырем гаплоидным наборам ДНК. Определение доли клеток, находящихся в S-фазе Для определения доли клеток в S-фазе используется метод Байсха и др.(H.Baisch, W.Gohde, W.A.Li de , 1975), модифицированный применительно к анеуплоидным клеткам. Суть метода состоит в построении прямоугольника, вписывающегося в пространство между G1- и G2-пиками. Высота этого прямоугольника определяется числом клеток, приходящихся на 10 центральных каналов области S-фазы, из которого вычисляется среднее число клеток на канал. Аналогичным способом можно определить долю анеуплоидных клеток в S-фазе при условии, что высоту прямоугольника (рис.1, Б) можно вычислить, используя ту часть гистограммы, которая не перекрывается с областью, отвечающей диплоидным клеткам. 3. Анализ параметров клеточного цикла Благодаря фундаментальным исследованиям в области экспериментальной биологии и клинической медицины были получены факты, касающиеся кинетики клеточного цикла. К настоящему времени уже накоплен определенный опыт работы по данному вопросу. Практически не существует ни одного органа или ткани человеческого организма, экспериментального животного, который бы не подвергался цитометрическому или цитоспектрофотометрическому анализу. На основании этих данных установлено, что содержание ДНК нормальных соматических клеток соответствует диплоидному набору хромосом (2с) и характеризуется одним модальным классом на ДНК-гистограмме. Значение этого параметра для одного и того же индивида может колебаться в пределах 30%. Наиболее выраженные вариации в содержании ДНК наблюдаются в клетках пролиферирующих органов – печени и селезенки. Эти данные были получены при определении содержания ДНК в ядрах клеток различных органов и тканей фенотически здоровых людей (130 проб – по 5 – 14 от каждого случая)(E.Muller, R.Weidhase, 1983). В изучаемых объектах схематически представлены фазы митотического цикла и распределение ДНК в различных тканях.
Он мог теперь без запинки привести все теории о болезнях, связанных с параличом кровеносных сосудов, указать, какое из учений уцелело в науке, какое осмеяно и забыто. Занявшись исследованием, Рогов ничего так страстно не желал, как добиться успеха и вызвать одобрение Быкова. Скромные сердца не страшатся лишений, легко переносят неудачу, но втайне жаждут любви и награды. Исследования проводили по методу павловской школы с помощью метронома, змеевика и прочих средств лаборатории. Изучались больные, перенесшие кровоизлияние в мозг. Пораженная кора одного из полушарий не воспринимает раздражений, и часть тела лишена чувствительности. Итак, каковы отправления сосудодвигательного центра, когда высший отдел мозга кора не проявляет себя? Ольга Степановна Петрова, почтенная мать обширного. семейства, позволила Рогову заключить ее правую, здоровую руку в плетисмограф, а левую, нечувствительную,P в змеевик с проточной холодной водой. Она поверила, что экспериментатор в белом халате врач, и безропотно исполняла его требования
1. Оборудование космических кораблей
2. Обзор сетевого оборудования фирмы Cisco
4. Иммунодиагностика и иммунотерапия рака молочной железы
5. История болезни по хирургии - рак желудка
10. История литейного оборудования (производства)
11. Оценка органов управления оборудования
12. Виды современного копировального оборудования. Что и как выбирать
14. Реконструкция основного оборудования отделения абсорбции
15. Анализ добывных возможностей скважин оборудованных УШГН, Павловского месторождения
16. Оборудование для ориентации полупроводниковых пластин
Ящик почтовый с замком, синий. 
Набор линеров "Sacura Pigma Micron", 3 штуки, черные. 
Конверт С6, комплект 1000 штук. 17. Технологическое оборудование для перерабатывающих отраслей АПК
18. Оборудование станции устройствами БМРЦ
19. Физические основы проектирования оборудования микроэлектроники
20. Техническое обслуживание и эксплуатация электрического и электромеханического оборудования
21. Технологическое оборудование для перерабатывающих отраслей АПК
25. Созвездие Рак
26. Применение радиоактивного йода при лечении дифференцированного рака щитовидной железы
27. Химиотерапия рака мочевого пузыря
28. Лучевая терапия рака предстательной железы
30. Рак желудка
32. История болезни - Онкология (периферический рак левого легкого)
Деревянная игрушка "Металлофон". 
Глобус Земли, физико-политический, рельефный с подсветкой, 250 мм. 
Средство для умягчения воды Calgon "2 в 1" (1,6 кг). 33. История болезни - Онкология (рак слепой кишки)
34. Онкология (колоректальный рак)
37. Онкология (рак поджелудочной железы)
41. Рецидив рака мочевого пузыря T2N0M0
42. Этиология рака, онкологические заболевания, сахарный диабет
43. Хирургия (Рак молочной железы)
44. Актуальные вопросы лечения рака почки
45. Рак простаты: вопросы диагностики и стадирования
46. Онкология (рак прямой кишки 2)
Качели детские подвесные (КД 150 ПЛ). 
Глобус Земли физико-политический, с подсветкой, рельефный, 250 мм (арт. Ве022500261). 
Подставка для бумаг вертикальная "Techno" (классическая). 50. Оборудование и технология эхо-импульсного метода ультразвуковой дефектоскопии
51. Прокатный цех (основное и вспомогательное оборудование)
52. Медитация против рака. Энтропийный подход
53. Помещение и оборудование парикмахерских
57. Оборудование производства ИУ
58. Разработка гидропривода технологического оборудования
59. Технология оборудования сварки
60. Электрическое оборудование городского электрического транспорта
61. Задачи по оборудованию портов
62. Оптимизация источников финансирования приобретения полиграфического оборудования
63. Рынок оборудования для корпоративных сетей на фоне макроэкономики и политики России и СНГ
64. Оборудование гастронома ( с установкой весового оборудования в торговом зале)
Полотенце махровое "Нордтекс. Aquarelle", серия "Волна" (цвет: светло-зеленый), 70х140. 
Набор детской складной мебели "Азбука" КУ2П/9. 
Записная книга "Bazar", А5, бирюзовая. 65. Лизинг оборудования для малого предпринимательства
66. Определение оптимального плана замены оборудования
67. Опасные зоны при работе производственного оборудования
68. Безопасная эксплуатация газовых проточных водонагревателей на промпредприятиях
69. Оценка пожарной опасности строительных материалов, конструкций и инженерного оборудования
73. Частотное регулирование и обеспечение информационной безопасности для оборудования Wi-Fi и WiMAX
75. Ранняя диагностика рака яичников
78. Подбор пылеулавливающего оборудования на асфальтобетонном заводе
80. Приобретение зерноуборочного комбайна и оборудования для уборки зерновых культур
Швабра-вертушка "Торнадо Хенди". 
Ручка "Автомат", 12 штук, в коробке. 
Гель для купания младенцев "Bubchen", 400 мл. 81. Разработка документации и постановка задачи "Учет наличия, состояния и движения оборудования"
82. Выбор и расчет оборудования для депарафинизации нефтяных скважин в условиях НГДУ "ЛН"
83. Оборудование при газлифтной и фонтанной эксплуатации скважин
84. Портативное оборудование защиты информации
85. Ремонт и модернизация компьютерной техники и периферийного оборудования
89. Технология и оборудование для нанесения припойной пасты
90. Модернизация, телекоммуникационного оборудования в ЗАО "Кузбассэнергосвязь"
91. Оборудование для создания локальных сетей
92. Оборудование предприятий общественного питания
93. Весоизмерительное оборудование электронное. Грузовой промышленный лифт
94. Виды технологического оборудования складов
95. Классификация и основные характеристики торгового оборудования. Требования
Тетрадь на резинке "Study Up", В5, 120 листов, клетка, оранжевая. 
Дорожная косметичка, 21x15x12 см, арт. 82629. 
Детский велосипед Jaguar трехколесный (цвет: розовый). 98. Проект на покупку комплекса оборудования по переработке сбросных дымовых газов котельной
99. Разработка бизнес-плана по закупке оборудования (на примере ООО "Саланг-Б")
