|
|
|
сделать стартовой | добавить в избранное |
 |
|
Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике |
Наклейки для поощрения "Смайлики 2". 
Ручка "Шприц", желтая. 
Ручка "Помада". Реферат Самойликов Павел Владимирович интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики» Российский государственный медицинский университет 2009 г. Введение. Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами. Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы. В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (e zyme li ked immu osorbe assay). В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ & dash; метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной. Иммуноферментный анализ. ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс. Рисунок 1. Основной принцып ИФА. 1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител. Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1). Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины. Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов. Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции.
В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода. Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса; 2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания; 3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. Классификация ИФА. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов: 1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы. А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним. Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания. 2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные. Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных. В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело. При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей. Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы & dash; носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы & dash; в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами. Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия & dash; образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом. 3. По принципу определения тестируемого вещества: А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания.
В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу. Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала. Характеристика компонентов, используемых в ИФА. Ферменты. Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда. Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами: & dash; высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками; & dash; наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции; & dash; возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению; & dash; отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости. В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и &be a;-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью. Субстраты. Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична. Основные требования к субстрату: & dash; обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате; & dash; образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат; & dash; субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения. Таблица 1. Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА. Фрмент Источник получения М.М. (кДа) Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм) Конъюгирующий реагент Пероксидаза хрена Хрен (Armoracia rus ica a) 40 О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм) 5-аминосалициловая кислота (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин. Глутаральдегид Мета-периодат натрия -сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат &be a;-D-галак-тозидаза E.
Это правило применяется вне зависимости от того, указан ли тот или иной вид деятельности в учредительных документах или нет[55]. Анализ устава ООО показал, что основным видом деятельности общества является садоводство, выращивание плодовых и ягодных культур, а также разведение овец, коз лошадей, крупного рогатого скота. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что ООО является сельскохозяйственным товаропроизводителем и намеривается использовать приобретенную землю по назначению. Как справедливо указано в решении, Учреждение Юстиции исходило из предположения о нарушении принципа целевого использования, что не может быть признано законным. Отказывая в регистрации, Учреждение сослалось на нарушение права преимущественной покупки, предусмотренного в ст.8 ФЗ "Об обороте земель сельскохозяйственного назначения". В соответствии с п.2 ст.270, п.2 ст.288 АПК РФ, применение при вынесении решения закона, который не может быть использован в спорном правоотношении, является основанием для отмены судебного акта судом апелляционной и кассационной инстанций
2. Основные принципы содержательно-тематического анализа текста
3. Принципы расчета и анализа длительности производственного цикла сложного процесса
4. Принципы построения и функционирования различного вида генераторов колебаний
9. Принципы психологического анализа в романе Л.Н.Толстого "Война и мир"
10. Принципы правового регулирования малого бизнеса: сравнительный анализ
11. Социальная ситуация в лесном комплексе и общие принципы ее анализа
12. Анализ принципов управления сельскими социально-производственными организациями в переходный период
13. Иммуноферментный анализ с усиленной хемилюминесценцией
14. Принципы системного анализа процессов и аппаратов экологически чистых технологий
15. Юридическая ответственность: понятие виды и принципы
16. Происхождение права, теории происхождения права, понятие признаки, виды, функции, принципы
Увлекательная настольная игра "Турбосчет". 
Бутылка под оливковое масло "Тоскана", 18x8,5x24 см, 1100 мл. 
Сковорода гриль-газ, мраморное антипригарное покрытие. 17. Учет и анализ доходов организации от обычных видов деятельности
18. Макроэкономический анализ инфляции: её виды, причины и последствия
19. Виды и принципы создания совместных предприятий в России
21. Виды анализа
25. Понятие, основные принципы и виды государственной службы
26. Сравнительные анализы видов договоров Гражданского кодекса Российской Федерации
27. Види, параметри та принцип роботи антен
28. Анализ применения различных видов рекламы в зависимости от жизненного цикла товара
29. Фармакогкостический анализ видов маклеи
30. Фармакогностический анализ лекарственных видов шалфея
31. Виды и анализ инвестиционных проектов
32. Сравнение как метод анализа. Виды и уровни сравнительных исследований
Глобус Земли, физический, 320 мм. 
Телескопическая ложка. 
Этикетка самоклеящаяся, А4, 1 этикетка, 210х297 мм, белая, 100 листов. 33. Анализ видов понятий и предложения по их использованию в практике логического обобщения выводов
34. Теория хроматографии, хроматографический анализ, виды хроматографии
35. Анализ производства и использования основных видов продукции растениеводства ЗАО "Зайцевское"
36. Основные понятия и виды экономического анализа
37. Реактивные двигатели, устройство, принцип работы
42. Статистика населения. Методы анализа динамики и численности и структуры населения
43. Анализ рынка углеводородов стран Центральной и Южной Азии
45. Статистический анализ демографической ситуации в Российской Федерации
46. Принцип построения налога на добавленную стоимость
47. Анализ доходов бюджета Российской Федерации
48. Нормативный и позитивный подход при анализе деятельности государства
Дополнительный набор "Что мне надеть". 
Коврик для сборки пазлов. 
Бумага "IQ Color", А4, 80 г/м2, 5 цветов по 50 листов, цветная пастель. 49. Налоги: эволюция, определения и формы. Принципы налоговой политики и функции налогов
50. Новые принципы осуществления валютного регулирования и валютного контроля в РФ
51. Анализ проблем возмещения ущерба, причиненного незаконными действиями государственных органов
52. Принципы гражданского процессуального права
53. Либерализм и марксизм: сравнительный анализ
58. Федеральная резервная система и политика НацБанка РБ: сравнительный анализ
59. Сравнительный анализ Правительств Киргизской Республики и Российской Федерации
60. Историко-правовой анализ Закона СССР "о разграничении полномочий между СССР и субъектами федерации"
61. Принцип разделения властей в Конституции РФ 1993г.
63. Способы формирования муниципальной собственности: правовое регулирование и сравнительный анализ
64. Анализ Закона РФ N1992-1 "О налоге на добавленную стоимость"
Пенал-книжка для начальной школы "Ever After High", 21x14 см. 
Набор инструментов. 65. Обзор и анализ проекта Налогового кодекса Российской Федерации
66. Анализ налоговой системы России. Некоторые аспекты
67. Принципы технического регулирования, порядок разработки, принятия технических регламентов
68. Понятие и принципы правового государства
73. Грамматический анализ субстантивированных прилагательных и причастий
74. Tupolev 154M noise asesment (Анализ шумовых характеристик самолёта Ту-154М)
76. Лексико-семантический анализ современных англоязычных рекламных слоганов
78. Анализ живописных произведений флорентийской школы конца XV - начала XVI веков
79. Метод действенного анализа в режиссуре театра, кино и телевидения
Экологичный стиральный порошок Garden Kids, без отдушек с ионами серебра, 1350 грамм. 
Штатив для создания снимков "сэлфи", зеленый. 
Контейнер хозяйственный универсальный, на колесах, 10 литров. 81. Древнегреческая и древнеримская культура - сравнительный анализ
82. Анализ новгородской иконы "Спас нерукотворный"
83. Анализ стихотворения А.С.Пушкина "Элегия"
84. Анализ авторской пунктуации в художественном тексте
85. Анализ романа "Преступление и наказание" Ф.М.Достоевского
89. Анализ стихотворения Блока "О доблестях, о подвигах, о славе..."
90. Анализ стихотворения Н.А. Заболоцкого "Завещание"
91. К анализу романа Булгакова "Мастер и Маргарита"
92. Принцип аналогии в морфологии
93. Сопоставительный анализ русских слов ошибка, заблуждение, ляпсус и французских faute, erreur, lapsus
94. Стилистический анализ стихотворения в прозе И.С. Тургенева "Собака"
95. Этимологический анализ слова "буржуазия"
96. Контент-анализ
Горшок дорожный и насадка на унитаз "HandyPotty" (лайм). 
Пенал "Гонка", 19х11 см, 3 отделения. 
Конструктор электронный "Знаток". 320 схем. 97. "Конармия". Анализ новеллы Бабеля "Мой первый гусь"
98. Анализ стихотворения А.А. Блока "О! Весна без конца и без краю!"
100. Анализ стихотворения Ахматовой "Родная земля"
Портфель "Attache", A4, серый. 
