![]() |
|
сделать стартовой | добавить в избранное |
![]() |
Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике |
Реферат Самойликов Павел Владимирович интерн кафедры «Клинической лабораторной диагностики» Российский государственный медицинский университет 2009 г. Введение. Методы иммунного анализа широко вошли в медицинскую практику. Во всех областях современной медицины используется иммунный анализ, преимущественно, с диагностической и аналитической целями. Особенно важно, что они дают возможность идентифицировать биологические компоненты (гормоны, ферменты, нейропептиды, продукты иммунной системы, антигены и т.д.) в низких и очень низких концентрациях. Все продукты, против которых возможно получение антител, выявляются этими методами. Иммунный анализ основывается на взаимодействии антигена (АГ) и антитела (АТ) с использованием различных вариантов мечения одного из компонентов (фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель и другие). Оценка реакции проводится автоматически на специальной аппаратуре, что позволяет стандартизировать эти методы. В зависимости от типа используемой метки и условий постановки теста иммунный анализ обозначается как иммуноферментный (ИФА), радиоиммунный (РИА), иммунофлуоресцентный и другие. При постановке реакций в один или несколько этапов они обозначаются как прямые или непрямые. Имеет значение среда, в которой проводится реакция. Если реакция проводится с реагентами, фиксированными на поверхности, то тест обозначается как твердофазный, например ELISA (e zyme li ked immu osorbe assay). В данной работе будет рассмотрен только иммуноферментный анализ & dash; метод широко распространенный в биологии и медицине, как практической, так и фундаментальной. Иммуноферментный анализ. ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс. Рисунок 1. Основной принцып ИФА. 1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител. Метод основан на специфическом связывании антитела с антигеном, при этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1). Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины. Появление моноклональных антител послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов. Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции.
В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой: Разнообразие объектов исследования от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливают разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода. Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии: 1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса; 2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания; 3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. Классификация ИФА. В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов: 1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы. А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним. Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания. 2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные. Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных. В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело. При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Анализ проводят очень быстро, для одного определения требуется 1 минута. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей. Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы & dash; носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы & dash; в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами. Методы относятся к гомогенно- гетерогенным, если 1 стадия & dash; образование специфических комплексов происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом. 3. По принципу определения тестируемого вещества: А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания.
В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу. Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала. Характеристика компонентов, используемых в ИФА. Ферменты. Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда. Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами: & dash; высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками; & dash; наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции; & dash; возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению; & dash; отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости. В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и &be a;-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью. Субстраты. Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична. Основные требования к субстрату: & dash; обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате; & dash; образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат; & dash; субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения. Таблица 1. Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА. Фрмент Источник получения М.М. (кДа) Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм) Конъюгирующий реагент Пероксидаза хрена Хрен (Armoracia rus ica a) 40 О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм) 5-аминосалициловая кислота (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин. Глутаральдегид Мета-периодат натрия -сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат &be a;-D-галак-тозидаза E.
Это правило применяется вне зависимости от того, указан ли тот или иной вид деятельности в учредительных документах или нет[55]. Анализ устава ООО показал, что основным видом деятельности общества является садоводство, выращивание плодовых и ягодных культур, а также разведение овец, коз лошадей, крупного рогатого скота. Данное обстоятельство свидетельствует о том, что ООО является сельскохозяйственным товаропроизводителем и намеривается использовать приобретенную землю по назначению. Как справедливо указано в решении, Учреждение Юстиции исходило из предположения о нарушении принципа целевого использования, что не может быть признано законным. Отказывая в регистрации, Учреждение сослалось на нарушение права преимущественной покупки, предусмотренного в ст.8 ФЗ "Об обороте земель сельскохозяйственного назначения". В соответствии с п.2 ст.270, п.2 ст.288 АПК РФ, применение при вынесении решения закона, который не может быть использован в спорном правоотношении, является основанием для отмены судебного акта судом апелляционной и кассационной инстанций
2. Основные принципы содержательно-тематического анализа текста
3. Принципы расчета и анализа длительности производственного цикла сложного процесса
4. Принципы построения и функционирования различного вида генераторов колебаний
9. Принципы психологического анализа в романе Л.Н.Толстого "Война и мир"
10. Принципы правового регулирования малого бизнеса: сравнительный анализ
11. Социальная ситуация в лесном комплексе и общие принципы ее анализа
12. Анализ принципов управления сельскими социально-производственными организациями в переходный период
13. Иммуноферментный анализ с усиленной хемилюминесценцией
14. Принципы системного анализа процессов и аппаратов экологически чистых технологий
15. Юридическая ответственность: понятие виды и принципы
16. Происхождение права, теории происхождения права, понятие признаки, виды, функции, принципы
17. Учет и анализ доходов организации от обычных видов деятельности
18. Макроэкономический анализ инфляции: её виды, причины и последствия
19. Виды и принципы создания совместных предприятий в России
21. Виды анализа
25. Понятие, основные принципы и виды государственной службы
26. Сравнительные анализы видов договоров Гражданского кодекса Российской Федерации
27. Види, параметри та принцип роботи антен
28. Анализ применения различных видов рекламы в зависимости от жизненного цикла товара
29. Фармакогкостический анализ видов маклеи
30. Фармакогностический анализ лекарственных видов шалфея
31. Виды и анализ инвестиционных проектов
32. Сравнение как метод анализа. Виды и уровни сравнительных исследований
33. Анализ видов понятий и предложения по их использованию в практике логического обобщения выводов
34. Теория хроматографии, хроматографический анализ, виды хроматографии
35. Анализ производства и использования основных видов продукции растениеводства ЗАО "Зайцевское"
36. Основные понятия и виды экономического анализа
37. Реактивные двигатели, устройство, принцип работы
42. Статистика населения. Методы анализа динамики и численности и структуры населения
43. Анализ рынка углеводородов стран Центральной и Южной Азии
45. Статистический анализ демографической ситуации в Российской Федерации
46. Принцип построения налога на добавленную стоимость
47. Анализ доходов бюджета Российской Федерации
48. Нормативный и позитивный подход при анализе деятельности государства
49. Налоги: эволюция, определения и формы. Принципы налоговой политики и функции налогов
50. Новые принципы осуществления валютного регулирования и валютного контроля в РФ
51. Анализ проблем возмещения ущерба, причиненного незаконными действиями государственных органов
52. Принципы гражданского процессуального права
53. Либерализм и марксизм: сравнительный анализ
58. Федеральная резервная система и политика НацБанка РБ: сравнительный анализ
59. Сравнительный анализ Правительств Киргизской Республики и Российской Федерации
60. Историко-правовой анализ Закона СССР "о разграничении полномочий между СССР и субъектами федерации"
61. Принцип разделения властей в Конституции РФ 1993г.
63. Способы формирования муниципальной собственности: правовое регулирование и сравнительный анализ
64. Анализ Закона РФ N1992-1 "О налоге на добавленную стоимость"
65. Обзор и анализ проекта Налогового кодекса Российской Федерации
66. Анализ налоговой системы России. Некоторые аспекты
67. Принципы технического регулирования, порядок разработки, принятия технических регламентов
68. Понятие и принципы правового государства
73. Грамматический анализ субстантивированных прилагательных и причастий
74. Tupolev 154M noise asesment (Анализ шумовых характеристик самолёта Ту-154М)
76. Лексико-семантический анализ современных англоязычных рекламных слоганов
78. Анализ живописных произведений флорентийской школы конца XV - начала XVI веков
79. Метод действенного анализа в режиссуре театра, кино и телевидения
81. Древнегреческая и древнеримская культура - сравнительный анализ
82. Анализ новгородской иконы "Спас нерукотворный"
83. Анализ стихотворения А.С.Пушкина "Элегия"
84. Анализ авторской пунктуации в художественном тексте
85. Анализ романа "Преступление и наказание" Ф.М.Достоевского
89. Анализ стихотворения Блока "О доблестях, о подвигах, о славе..."
90. Анализ стихотворения Н.А. Заболоцкого "Завещание"
91. К анализу романа Булгакова "Мастер и Маргарита"
92. Принцип аналогии в морфологии
93. Сопоставительный анализ русских слов ошибка, заблуждение, ляпсус и французских faute, erreur, lapsus
94. Стилистический анализ стихотворения в прозе И.С. Тургенева "Собака"
95. Этимологический анализ слова "буржуазия"
96. Контент-анализ
97. "Конармия". Анализ новеллы Бабеля "Мой первый гусь"
98. Анализ стихотворения А.А. Блока "О! Весна без конца и без краю!"