|
|
|
сделать стартовой | добавить в избранное |
 |
|
Постановка реакции ПЦР |
Мыло металлическое "Ликвидатор". 
Гуашь "Классика", 12 цветов. 
Брелок LED "Лампочка" классическая. Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Реферат на тему: Постановка реакции ПЦР Челябинск 2008 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Устройство, задачи и функции лаборатории иммунологического типирования тканей Выделение ДНК из венозной крови Проведение ПЦР Ход реакции Анализ ПЦР-амплифицированной ДНК Заключение ВВЕДЕНИЕ В начале 1970-х годов норвежскому ученому Къеллу Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Har Gobi d Khora a) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК - синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кери Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию. ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний, используется для подбора гистосовместимого донора органов и тканей, регистрации всех потенциальных реципиентов, нуждающихся в тканевых и органных трансплантантах, проведения иммунологического контроля за приживлением пересаженных органов и тканей. Устройство, задачи и функции лаборатории иммунологического типирования тканей 1. Общие положения. 1.1. Лаборатория иммунологического типирования (ИТ) организуется в составе станции переливания крови. 1.2. Лаборатория ИТ осуществляет методическое руководство иммунологическим типированием тканей в лечебных учреждениях подконтрольных административной территории. 1.3. Лаборатория ИТ осуществляет связь с лечебно-профилактическими учреждениями зоны с целью подбора гистосовместимого донора органов и тканей, регистрации всех потенциальных реципиентов, нуждающихся в тканевых и органных трансплантантах, проведения иммунологического контроля за приживлением пересаженных органов и тканей. 2. Основные задачи лаборатории иммунологического типирования: организационно-методическое руководство за проведением тканевого типирования в лечебно-профилактических учреждениях административной зоны; организация сбора, исследование сывороток на наличие анти-HLA антител; исследование антигенного состава тканей больных с различными заболеваниями, доноров тканевых и органных трансплантатов. 3. Функции лаборатории иммунологического типирования: 3.1. Лаборатория обеспечивает всеми видами иммунологического исследования больных, находящихся в лечебно-профилактических учреждениях курируемого региона. 3.2. Лаборатория исследует антигенный состав тканей потенциальных доноров тканевых и органных трансплантатов и реципиентов, составляет картотеки типированных доноров и реципиентов, осуществляет поиск совместимых пар донор-реципиент. 3.3. Проводит прямые и обратные пробы на совместимость между сывороткой и форменными элементами крови донора и реципиента.
3.4. Проводит наблюдение иммунологическими методами за развитием посттрансфузионных реакций и приживлением тканевых и органных трансплантатов. 3.5. Участвует в составлении планов по повышению квалификации сотрудников лечебно-профилактических учреждений зоны по иммунологическому типированию тканей. 3.6. Организует разъяснительную работу в лечебно-профилактических учреждениях зоны по вопросам клинического значения иммунологических исследований. Выделение ДНК из венозной крови Перед выделением ДНК необходимо приготовить рабочий раствор солевого буфера. Для этого Содержимое флакона с 10-кратным Солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96% этиловым спиртом довести до метки 300 мл и перемешать. Готовый рабочий раствор Солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4˚С. Солевой буфер необходим для дальнейшей промывки осадка с ДНК. Выделение ДНК проводят в специализированном боксе для выделения. Необходимо соблюдать правила техники безопасности: - руки должны быть защищены одноразовыми перчатками, которые утилизируются после выделения; - дыхательные пути защищены одноразовой маской, которая также подлежит утилизации после использования; - лаборант во время выделения должен быть одет в специальный халат, шапочку и очки. Все манипуляции с исследуемым материалом проводят при соблюдении правил работы с вирусами III и IV группы. Постановку ПЦР осуществляют как минимум в 3 рабочих зонах: Зона 1 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка ПЦР-реагентов. Зона 2 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка проб и контролей, выделение ДНК, внесение проб в пробирки с ПЦР-реагентами, проведение амплификации. Зона 3: детекция амплифицированной ДНК. Пробы из зоны 3 запрещено переносить в зоны 1 и 2 во избежание контаминации ДНК-матрицей. Пипетки или наконечники должны иметь аэрозольный барьер. Перчатки и халаты необходимо менять при переходе из одной зоны в другую. Оборудование, необходимое для выделения ДНК: – ламинарный бокс или стерилизуемое УФ-излучением помещение; – одноразовая пластиковая посуда (стерильные пробирки типа &quo ;Эппендорф&quo ; объемом 1,5; 0,5; 0,2 мл); – автоматические пипетки объемом от 0,5 мкл до 1 мл; – сменные одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами; – центрифуга типа &quo ;Эппендорф&quo ; с охлаждением и скоростью не менее 10000 g; – встряхиватель (&quo ;Вортекс&quo ;); Выделение ДНК из венозной крови проводят в несколько этапов: В пробирку объёмом 1,5 мл внести 300 мкл исследуемой пробы, добавить 800 мкл Лизирующего реагента и перемешать содержимое пробирки переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется. Лизирующий реагент необходим для разрушения клеток крови и экстракции из них ДНК. Термостатировать пробирку со смесью 5-7 мин. При температуре 65˚С. Если выделение ДНК проводится из твёрдого сухого мелкоизмельчённого материала, то следует термостатировать 30-40 мин. После термостатирования центрифугировать пробирку со смесью 10 сек при 5000 об. в мин., в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворённый осадок.
Прозрачный супернатант целиком перенести в чистую пробирку. В пробирку с чистой смесью добавить 45 мкл суспензии сорбента ucleoS M. Перед использованием ucleoS M следует интенсивно перемешать до гомогенной суспензии на вортексе. ucleoS M необходим для того, чтобы на его частицах осела выделенная из клеток ДНК. Пробирку поместить на ротатор и перемешивать 10 мин (10-20 об/мин) для лучшего оседания выделенной ДНК на частицах кремния. Центрифугировать 10 сек при 5000 об. в мин. Осторожно, не задевая осадок, удалить супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку добавить 400 мкл Лизирующего реагента, тщательно перемешать на вортексе до полного гомогенного состояния. Если супендирование затруднено (при большой нагрузке ДНК) из-за слипания сорбента, то его необходимо вначале суспендировать наконечником пипетки, а затем на вортексе. Добавить в пробирку 1 мл рабочего раствора Солевого буфера и перемешать содержимое переворачиванием пробирки 5-10 раз. Центрифугировать 10 сек при 5000 об. в мин. Осторожно удалить супернатант, не задевая осадок, с помощью водоструйного насоса. Повторить промывку дважды Для этого необходимо добавлять по 1 мл Солевого буфера, перемешивать содержимое пробирки на вортексе, центрифугировать 10 сек. при 5000 об. в мин. и удалять прозрачный супернатант. Просушить осадок при температуре 65˚С в течение 3-4 мин. В эту же пробирку внести 300 мкл ЭкстраГена ЕТМ, который необходим для отделения промытой ДНК от частиц кремния. ЭкстраГен ЕТМ следует отбирать от общего объёма при постоянном перемешивании. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 сек до получения гомогенной суспензии, затем термостатировать 4-5 мин при 65˚С. Ещё раз суспендировать содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием. Центрифугировать 1 мин при 10000 об. в мин. Перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку. ДНК хранить при температуре -20˚С. Проведение ПЦР Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (i vi ro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований. Компоненты реакции Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. Термостабильная ДНК-полимераза— фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов— hermus aqua icus ( aq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Надо]садочную жидкость отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56`С в те]чение 30 мин, и в ней определяют число бледных трепонем в тем]ном поле зрения, просматривая 10 полей зрения. Ампулирование производят сразу или на 2-3-й день после приготовления антигена. На ампулах с антигеном обозначают серию антигена, дату его изго]товления и среднее число бледных трепонем в одном поле зрения. Перед каждой постановкой РИП необходимо определять количе]ство бледных трепонем в антигене. Рабочий антиген должен содер]жать 15-20 бледных трепонем в поле зрения. Антиген применяется в дозе 0,3 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимо]го количества антигена делается в день постановки реакции. Напри]мер, для исследования 50 сывороток крови нужно 0,3х55, что в результате дает 16,5 мл рабочего антигена (поскольку необходимо взять на 5 пробирок больше с учетом контролей и случайных по]терь). Комплемент растворяют согласно указанию на этикетке, вводят в дозе 0,05 мл в опыт
1. Проблемы постановки рук (теоретическое обоснование)
2. Постановка задачи линейного программирования и двойственная задача линейного программирования.
3. Постановка лабораторной работы по курсу волоконнооптические системы связи
4. Апории Зенона и первая теоретическая постановка проблемы бесконечности
5. Постановка маркетинга в АО "Вятский торговый дом"
9. Линейное программирование: постановка задач и графическое решение
10. Критерии постановки хирургических заболеваний
12. Метод массовой постановки певческого голоса
13. Постановка целей
14. «Высота планки» при постановке учебных целей как один из факторов успешности обучения
15. Вот где задача зарыта! Алгоритм постановки задач рекламной кампании
16. Виртуальная политика: постановка проблемы
Книга-сейф "Английский словарь", цвет: черный, 24 см. 
Карандаши для левшей "EasyColors", 12 цветов. 
Муфта для коляски Bambola (шерстяной мех + плащевка + кнопки), черная. 18. Анклавный язык в составе языкового союза (к постановке проблемы)
19. Способы постановки диагноза пр лечении птиц
21. Постановка, настройка и исследование абонентского программного обеспечения сети Internet
25. Аудит постановки бухгалтерского учета и внутрибанковского контроля в банке
26. Постановка поисково-оценочного бурения на Иньвинской площади
27. Постановка и решение транспортной параметрической задачи
28. Постановка задачі оптимального стохастичного керування
29. Жанры поздравлений. К постановке проблемы
30. Выбор маркетинговой стратегии и постановка целей в маркетинге
31. Постановка и внедрение элементов системы оперативного контроллинга на предприятии
32. Система разработки и постановки продукции на производство
Сумка-транспортный чехол усиленная для колясок "Книжка". 
Магниты "Standart", 0,7 кг, 30 мм, темно-синие, 10 штук. 
Светильник с датчиком света и движения "Майти лайт". 33. Архитектура и общественная безопасность: постановка проблемы
34. Прогнозирование рисков и постановка бюджетирования на промышленном предприятии
35. Теоретическое значение антропологии
36. Значение сна и сновидений. Предупреждение нарушений сна
37. Кораллы. Разнообразие и значение
41. Значение разделов Польского государства 1772, 1793, 1794 годов
42. Движение декабристов. Причины, характер движения. Судьба и значение движения
43. Соборное Уложение 1649 г. и его значение
44. Налоговый контроль, его сущность и значение
45. Налоговое регулирование: место и значение в рыночной экономике
47. Трудовой договор, его значение и особенности в современных экономических условиях
48. Значение института несостоятельности (банкротства)
Качели детские деревянные "Волна". 
Соковарка "Webber" ВЕ-06. 
Настольная игра "Доббль: Цифры и формы" (Spot It! Numbers & Shapes). 49. Пословицы, поговорки английского языка. Их значение, употребление и русские эквиваленты
50. Культура: особенности и значение, взгляды и понятия
51. Русское юродство как феномен культуры, его национальное значение
52. Культура, её значение в жизни человека и общества
53. Значение текста в художественном образе древнерусской рукописной книги конца XIV – начала XV века
57. Концепция Л.Н. Гумилева "Этногенез и биосфера земли" и ее значение в развитии философии истории
59. Значение логики
60. База данных - Бактериологическая испытательная лаборатория Боханского района
61. Содержание и значение математической символики
62. Моделирование значений случайных векторов
63. Значение "Канон" врачебной науки для развития медицины /Авицена/
64. История болезни (туберкулез)
Зеркальце карманное "Котик", 8x7 см. 
Коробка подарочная "Цветы и павлиньи перья". 
Шар для принятия решений. 65. Характеристика и значение деловых игр в медицине
66. Лечение туберкулеза костей и суставов
67. Работа медицинского лаборанта в экспресс-лаборатории и отделении реанимации
68. Инфильтративный туберкулез легких S1-2,6 справа
73. Значение взаимоотношений в семье в развитии ребенка, его будущей жизни
74. Воображение: понятие и значение в жизни человека
75. Любовь и ее значение в жизни человека
77. Генератор числовой последовательности
79. Благословение Патриархом Иаковом своих сыновей и пророчески прообразовательное его значение
80. Влажность воздуха и её значение
Настольная игра "Много-Много", новая версия. 
Настольная игра "Живые картинки (Schau Mal)". 
Подгузники Merries (S), 4-8 кг, 24 штуки. 81. Социальное значение спорта
83. Методологическое значение сравнительного метода в зоологических исследованиях
85. Валютный клиринг: Мировой опыт и его значение для стран СНГ
89. Значение экономического учения Карла Маркса
91. Формирование рыночной стратегии и ее значение в деятельности предприятия и организации
92. Сущность и экономическое значение лизинга
94. Значение вексельного обращения
95. Сущность и значение денег. Структура денежной массы. Денежные агрегаты
96. Значение и роль туризма в физическом воспитании, виды простейших туристических соревнований
Подгузники "Солнце и Луна. Нежное прикосновение", размер: 2/S (3-6 кг), 70 штук. 
Машинка закаточная (улитка, полуавтомат) "Мещера-1". 
Игра магнитная "Одевашки. Настя". 97. Декларация о государственном суверенитете Украины и ее историческое значение
98. Модернизация в традиционных укладах. Опыт Италии и его значение для России
99. Значение и последствия войны 1812 года
